全基因組獲得性功能的篩選文庫

產品簡述

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SAM文庫強效激活轉錄 ——全基因組獲得性功能的篩選

SAM文庫可強特異性激活基因組中編碼基因的轉錄,用于在人類細胞中進行功能獲得性篩選。 CRISPR/Cas9協同轉錄激活調節子(SAM)是一種設計的蛋白復合物,能夠強效激活內源性基因的轉錄。失活的Cas9核酸酶通過gRNA靶向于基因組中的特異性位點。SAM復合物包含3個轉錄激活結構域-VP64,P65和HSF1,可靶向于轉錄起始位點上游200bp位點,從而起到協同加強下游基因轉錄的作用。SAM使用失活的Cas9以確保不造成內源基因組的鏈斷裂。人全基因組SAM文庫可激活RefSeq數據庫 (23,430亞型)中的所有已知的編碼亞型,以用于功能獲得性的篩選。SAM文庫已經被廣泛使用于原代的小鼠,人細胞,干細胞,癌細胞及各種穩定細胞系。SAM文庫篩選允許客戶在不同條件下鑒定任何細胞存活必須的基因,以及那些因為激活使癌細胞產生耐藥性的基因。如需了解關于SAM文庫設計&構建的完整信息,可查看文獻:Konermann S*, Brigham MD*, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki O & Zhang F. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature, doi:10.1038/nature14136.

SAM文庫內容

  • 70,290 gRNA序列;靶向人類基因組中23,430個不同的編碼亞型,每3條sgRNA序列即靶向1個編碼亞型

  • Human SAM 文庫克隆至pLenti sgRNA(MS2)_zeo載體

  • 另隨文庫附上lenti dCas9-VP64_Blast及lenti MS2-P65-HSF1_Hygro兩個質粒。


SAM文庫交付

Cat. No.文庫名稱載體交付量+周期*
HKC070-1Human SAM Library

pLenti sgRNA(MS2)_zeo
pLenti dCas-VP64_Blast
pLenti MS2-P-HSF1_Hygro

1 μg

5-7

HKC070-25

25 μg

5-7

HKC070-100

100 μg

5-7

HKC070-200

200 μg

5-7

HKC074Customized Human SAM Library

pLenti sgRNA(MS2)_zeo
pLenti dCas-VP64_Blast
pLenti MS2-P-HSF1_Hygro

100 μg-900 μg**

8-10 weeks

+ 文庫以25 μg為單位交付;4 x 25 μg(100 μg 文庫)或8 x 25 μg (200 μg 文庫);*交付周期為工作日;**需求量可以100 μg為單位向上增加。

如何使用SAM文庫,用于功能獲得性的篩選

SAM文庫是CRISPR gRNA 混合文庫,直接靶向基因組每一個轉錄起始位點的上游。

對于SAM 功能獲得性的篩選,人全基因組的SAM sgRNA文庫需與另外兩個SAM元件結合,即dCas9-VP64 與MS2-P65-HSF1,這三個SAM元件共同轉導入細胞中。為適于共轉導及篩選,三個慢病毒載體都有各自的抗性標記。三個元件都是以慢病毒載體形式交付,且病毒載體都是經過優化的,能夠復制高滴度,以有效轉導原代細胞或培養細胞系。SAM 文庫以較低的MOI值轉導到細胞群中,以保證每個細胞進入不超過1條gRNA。轉導完成后在進行文庫篩選之前,應對細胞進行NGS深度測序,以評估gRNA在細胞中的表現。篩選完成后,進行第二輪NGS測序并數據分析,用于鑒定篩選過程中丟失或富集的gRNA。為了篩選到SAM文庫中的陽性克隆,您需對多個富集gRNA的基因進行鑒定。更多SAM篩選流程,請參考SAM/Genome Engineering網站。

SAM 文庫構成

SAM復合物由三部分構成:

  • 核酸酶活性失活的Cas9-VP64融合蛋白

  • sgRNA,其形成的莖環部分包含了兩個MS2 RNA適配子

  • MS2-P65-HSF1激活輔助蛋白

三個不同的激活結構域- VP64, P65 and HSF1, 協同激活轉錄

三個元件都由單獨的慢病毒載體編碼。 所有三個載體必須共轉染進細胞才能使得SAM發揮作用 人全基因組的SAM gRNA文庫序列可點擊這個.csv文件中獲取

SAM文庫載體

我們交付的SAM文庫是一個混合文庫,包含:sgRNA克隆到gRNA慢病毒表達載體,以及需要共同轉導的dCas9-VP64 和 MS2-p65-HSF1慢病毒表達載體。

載體名稱選擇標記載體圖譜

lenti sgRNA(MS2)_zeo

Zeo


lenti dCas9-VP64_Blast

Blast


lenti MS2-P65-HSF1_Hygro

Hygro

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Pathway-focused CRISPR gRNA 文庫
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