酵母三雜交文庫篩選服務

與酵母雙雜交系統相同,三雜交系統也是利用轉錄激活子調控真核基因轉錄的特點,許多轉錄激活子由結構上可分而功能上獨立的兩個結構域組成。如酵母Gal4轉錄激活子包括DNA結合域(DNA binding domain,DNA-BD)和轉錄激活域(activation domain,AD)。將DNA-BD與誘餌蛋白X融合,AD與靶蛋白Y融合,分別構建BD-X和AD-Y重組質粒載體,并在酵母細胞中共表達。如果誘餌蛋白X與靶蛋白Y相互作用,DNA-BD和AD相互靠近,重組成有活性的Gal4轉錄激活子,DNA-BD與上游激活序列(UAS)結合,而AD則激活下游報告基因(如lacZ或HIS3)的轉錄。通過檢測β-半乳糖苷酶活性可確定LacZ基因的表達水平。此外,HIS3編碼咪唑甘油磷酸脫氫酶(His3p),能使酵母在組氨酸缺陷培養基上生長。3-氨基-1,2,4三唑(3-AT)是His3p的競爭性抑制劑,His3p表達水平高的細胞能在含有較高3-AT濃度的培養基上生長,因此,酵母細胞對3-AT的抑制水平體現了蛋白-蛋白相互作用的強度。


  • 產品詳情

酵母三雜交文庫篩選:


1.實驗原理

與酵母雙雜交系統相同,三雜交系統也是利用轉錄激活子調控真核基因轉錄的特點,許多轉錄激活子由結構上可分而功能上獨立的兩個結構域組成。如酵母Gal4轉錄激活子包括DNA結合域(DNA binding domainDNA-BD)和轉錄激活域(activation domainAD)。將DNA-BD與誘餌蛋白X融合,AD與靶蛋白Y融合,分別構建BD-XAD-Y重組質粒載體,并在酵母細胞中共表達。如果誘餌蛋白X與靶蛋白Y相互作用,DNA-BDAD相互靠近,重組成有活性的Gal4轉錄激活子,DNA-BD與上游激活序列(UAS)結合,而AD則激活下游報告基因(如lacZHIS3)的轉錄。通過檢測β-半乳糖苷酶活性可確定LacZ基因的表達水平。此外,HIS3編碼咪唑甘油磷酸脫氫酶(His3p),能使酵母在組氨酸缺陷培養基上生長。3-氨基-1,2,4三唑(3-AT)是His3p的競爭性抑制劑,His3p表達水平高的細胞能在含有較高3-AT濃度的培養基上生長,因此,酵母細胞對3-AT的抑制水平體現了蛋白-蛋白相互作用的強度。

 1 蛋白三雜交系統

Fig. 1 protein-dependent three-hybrid system


與酵母雙雜交系統不同,三雜交是研究兩個蛋白和第三個成分間的相互作用,通過第三個分子使兩個雜合蛋白相互靠近。第三個成分不同,可以是蛋白、RNA或小分子。在以蛋白為基礎的三雜交系統中,蛋白XY的穩定相互作用依賴于蛋白Z的存在,Z介導相互作用或誘導一個蛋白的構象改變(如X),從而促進與另一個蛋白Y的相互作用(圖1)。在以RNA為基礎的三雜交系統中,DNA結合域(LexA BDGal4 BD)與RNA結合蛋白(如MS2-外殼蛋白或Hiv-1 RevM10)融合成第一個雜合蛋白,轉錄激活域(Gal4 AD)與感興趣的RNA結合蛋白Y融合成第二個雜合蛋白。第三個雜合RNA分子包含與第一個RNA結合蛋白(MS2RRE)結合的位點(RNA)以及RNA結合蛋白Y結合的位點X。蛋白YRNA結合位點X結合形成具功能的轉錄激活子(圖2)。在小分子三雜交系統中,第三個雜合分子為異源二聚化的小分子復合物(如Dex–FK506DeX-Mtx,使BD-XAD-Y融合蛋白相互靠近,重新組成具有功能的轉錄激活子(圖3)。在SenGupta[1] 最早提出的三雜交系統中,第一個雜合蛋白LexABD-MS2由酵母的L-40膜蛋白編碼,第二個雜合蛋白Gal4AD-Y由質粒表達,雜合RNA 分子由RNA聚合酶Ⅲ產生,包括RNAse P 5′前導序列和3′尾隨序列(位于mRNA終止密碼子后)。RNA聚合酶Ⅲ含有一段由4個或多個T殘基形成的轉錄終止子,而許多RNA 結合蛋白識別富含URNA靶標,不能被RNA聚合酶Ⅲ轉錄。Putz[2]利用RNA聚合酶Ⅱ轉錄RNA雜合分子,從而避免富含U的靶RNAs成熟前的轉錄終止。


                                                  圖2 RNA介導的三雜交系統                                      圖3 小分子三雜交系統

                                Fig.2  RNA-dependent three-hybrid system            Fig.3 Small molecule three-hybrid system

2. 我們的工作內容

    您只需提供用于篩選的誘餌質粒信息,我們會完成整個的篩選工作,主要包括以下內容:
2.1 誘餌載體的構建
2.2 誘餌質粒的自激活檢測
2.3 文庫質粒和誘餌質粒共轉酵母感受態細胞
2.4 文庫篩選和3AT優化
2.5 文庫篩選結果測序分析
2.6 篩選結果回轉驗證
2.7 詳細報告的整理和數據發送

3.交付結果

提供詳細的、完整的實驗報告,清晰的實驗圖片,篩選結果的測序結果,質粒等。

4.服務報價

3.2萬元整

5.服務周期

80個工作日


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